Tráfego intracelular e glicosilação de hidroxiprolina

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 13506 (2023) Citar este artigo

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A expressão de proteínas recombinantes em células vegetais com um peptídeo hidroxiprolina (Hyp) -O-glicosilado “projetado” (HypGP), como repetições em tandem de um motivo “Ser-Pro”, demonstrou aumentar o rendimento da proteína secretada. No entanto, a secreção dramática e a glicosilação de Hyp-O de proteínas marcadas com HypGP só podem ser alcançadas quando as células vegetais foram cultivadas em meio SH deficiente em azoto. Apenas vestígios de proteína de fusão segregada foram detectados em meio MS. Este estudo visa obter uma compreensão mais profunda do possível mecanismo subjacente a estes resultados, examinando o tráfego intracelular e a hip-O-glicosilação da proteína fluorescente verde melhorada (EGFP) fundida com um marcador (SP)32, consistindo em 32 repetições de um " Motivo Ser-Pro", em células BY-2 de tabaco. Quando as células foram cultivadas em meio MS, o (SP)32-EGFP formou um agregado semelhante a um corpo proteico e foi retido no RE, sem sofrer Hip-O-glicosilação. Em contraste, a proteína de fusão torna-se totalmente hip-O-glicosilada e depois segregada em meio SH. A análise do transcriptoma das células BY-2 cultivadas em meio SH vs. meio MS revelou mais de 16.000 DEGs, com muitos DEGs regulados positivamente associados ao movimento baseado em microtúbulos, movimento do componente subcelular e ligação aos microtúbulos. Estes DEGs são presumivelmente responsáveis ​​pelo transporte aumentado de ER-Golgi de proteínas marcadas com HypGP, permitindo a sua glicosilação e secreção em meio SH.

A célula vegetal emergiu como uma poderosa plataforma de bioprodução para proteínas farmacêuticas recombinantes, uma vez que oferece vantagens em segurança e custo-benefício em relação a outros organismos eucarióticos . Semelhante às células de mamíferos, as células vegetais são cultivadas em um ambiente estéril e controlado e o cGMP pode ser facilmente implementado em todo o processo de produção. Nas últimas duas décadas, foram feitos progressos substanciais na melhoria do sistema de cultura de células vegetais, resultando em alguns casos de sucesso comercial. Notavelmente, o medicamento órfão Elelyso®, aprovado pela FDA, é uma enzima terapêutica produzida por células vegetais (glicocerebrosidase) para o tratamento da doença de Gaucher, que se tornou a primeira proteína farmacêutica produzida por células vegetais do mundo usada em humanos4,5. Apesar deste avanço, vários desafios técnicos limitam as aplicações comerciais generalizadas desta plataforma. O desafio mais significativo é a baixa produtividade, com rendimentos de proteína variando de 1,0 µg/L a 10 mg/L6,7,8. Além disso, a proteína de interesse tende a acumular-se intracelularmente, levando ao aumento dos custos de purificação de proteínas.

Esses desafios técnicos foram recentemente abordados por uma tecnologia proprietária, denominada engenharia HypGP, que envolve a expressão de uma proteína recombinante fundida com um marcador de peptídeo hidroxiprolina (Hyp)-O-glicosilado (HypGP), que pode estar na forma de repetições em tandem de um Motivo “Ser-Pro” ou um motivo “Ala-Pro”, denotado (SP)n e (AP)n (n = 5, 10, 20, 32). A etiqueta HypGP poderia funcionar como um transportador molecular na promoção do transporte eficiente de proteínas unidas para meios de cultura. Como resultado, esta tecnologia aumentou significativamente os rendimentos secretados de várias proteínas recombinantes em culturas de células vegetais9,10,11,12,13 e microalgas14. No entanto, descobriu-se que a secreção e a glicosilação Hyp-O de proteínas marcadas com HypGP em células vegetais foram grandemente afetadas pela composição do meio de cultura . Notavelmente, proteínas marcadas com HypGP totalmente glicosiladas foram secretadas em grandes quantidades quando as células BY-2 foram cultivadas em meio Schenk e Hildebrandt (SH) deficiente em nitrogênio, o que resultou em baixo acúmulo de biomassa celular. Em contraste, uma pequena quantidade de proteína secretada foi detectada quando células BY-2 foram cultivadas em meio Murashige e Skoog (MS) rico em nitrogênio que apoiou o rápido crescimento celular e alto acúmulo de biomassa. Em ambos os casos, as proteínas intracelulares marcadas com HypGP permaneceram não glicosiladas9,15,17,18. Curiosamente, quando as proteínas marcadas com HypGP foram expressas em plantas inteiras (Nicotiana tabacum e Nicotiana benthamiana), a maioria das proteínas sintetizadas também permaneceu não glicosilada .